作者：魏锦，袁国华，周京国，蔚芃，唐中，杨明辉，张国元【摘要】  目的  探讨甲氨喋呤（MTX）和雷公藤多甙（TG）对类风湿关节炎（RA）滑膜细胞产生CC趋化因子受体5配体（CCL5）的影响。方法  分离于11例RA和6例骨关节炎（OA）的滑膜细胞行体外培养，并用细胞脂多糖（LPS）诱导CCL5产生，同时加入或不加入不同浓度的MTX或TG。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定培养上清液中的CCL5水平。结果  RA滑膜细胞体外自发产生CCL5水平高于OA滑膜细胞（P<0.05）；LPS刺激后，RA和OA滑膜细胞产生CCL5水平均较刺激前显著升高（P均<0.001），但二者间差异无显著性（P>0.05）；MTX和TG均可显著抑制RA滑膜细胞产生CCL5，但二者抑制方式不同：MTX剂量在5～20ng/ml的剂量范围内呈现剂量依赖性效应，之后随剂量的增大，其抑制作用不再进一步增强。而TG 未显示出剂量依赖性抑制效应，仅在剂量达到或超过60ng/ml时出现比MTX更显著的抑制作用。进一步分析发现，TG抑制CCL5产生与其所致的滑膜细胞死亡相关。结论  RA滑膜细胞产生CCL5增高，MTX和TG均可显著抑制CCL5的产生，其中TG抑制CCL5产生与其细胞毒作用有关。    【关键词】  关节炎  类风湿  趋化因子受体5配体  滑膜细胞    The inhibitory effects of methotrexate and tripterygium glycosides on chemokine CCL5 production in synoviocytes from patients with rheumatoid arthritis    【Abstract】  Objective  To determine the inhibitory effects of methotrexate (MTX) and tripterygium glycosides (TG) on chemokine CCL5 production in synoviocytes isolated from patients with rheumatoid arthritis (RA).Methods  Synoviocytes， isolated from RA patients and patients with osteoarthritis (OA)， were cultured and stimulated with or without lipopolysaccharide (LPS) in the presence or absence of different dosage of MTX or TG. CCL5 level in cultural supernatants was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Results  RA synoviocytes spontaneously produced higher level of CCL5 than OA synoviocytes did. Both MTX and TG were found to significantly inhibit LPS-induced CCL5 production in RA synoviocytes. Moreover， the inhibitory effect of MTX appeared to be in a dosage dependent manner in the concentration ranged from 0- 20ng/ml. Whereas TG showed its inhibitory effect only when it reached at the concentration of 60ng/ml. Furthermore， the inhibitory effect of TG was found to be correlated with TG-induced cell death.Conclusion  The increased production of CCL5 by RA synoviocytes indicates a role of CCL5 in the pathogenesis of RA， and the disease modifying effects of MTX and TG might be existed through their anti-CCL5 effect.    【Key words】  arthritis  rheumatoid  chemokines  CC  CCL5    　　类风湿关节炎（RA）是一种常见的慢性炎性关节炎，其病理特征为大量炎性细胞在滑膜的浸润和在滑液的渗出，及由此导致的滑膜增生，血管翳形成，最终造成关节软骨破坏。近期的研究结果显示，趋化因子（chemokine）在RA的炎性细胞关节浸润中起着极为重要的作用［1］。我们发现RA患者血清和滑液CC趋化因子受体5（CCR5）的配体CCL5（RANTES）水平增高，并证实滑膜细胞是其产生的主要部位，并且在用甲氨喋呤（MTX）和雷公藤多甙（TG）治疗后，CCL5水平下降［2，3］。为了进一步探讨MTX和TG在RA滑膜细胞产生CCL5的作用，我们通过体外滑膜细胞培养方法，观察MTX和TG对RA滑膜细胞产生CCL5的影响。    1  资料与方法    1.1  一般资料  在本院就诊的、有膝关节积液的RA患者11例，男3例，女8例，年龄21～68岁，平均年龄41岁，病程6个月～18年，平均7.4年。所有病人均符合美国风湿病学会1987年的RA诊断标准［4］，且近1个月内未用改变病情药物（DMARD）和甾体类激素。另选择有膝关节积液的OA患者6例作为对照组，其中男2例，女4例，年龄42～78岁，平均年龄49.3岁，病程2.6～12年，平均9.3岁。    1.2  滑膜细胞的分离与培养  实验采用滑液中的游离滑膜细胞进行培养。患者在无菌条件下行膝关节穿刺，抽取关节液后，在4℃ 1000 r/min离心10min，去上清后用无菌冷PBS 10ml悬浮细胞，经100目尼龙网过滤去除凝块沉渣，细胞再用冷PBS洗2次后，悬浮于DMEM培养液（含10%小牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素），混匀后取10ml行台盼蓝染色，活细胞计数。收集到的细胞接种于培养皿，置CO2自动控制培养箱，于37℃培养12h后，更换培养液去除非粘壁细胞，重复2～3次，至显微镜下观察绝大部分细胞呈梭状成纤维样细胞为止。用胰蛋白酶法收集滑膜细胞，按105细胞/ml，每孔0.5ml复种于24孔培养板。    1.3  滑膜细胞刺激  在预实验中发现，体外培养的滑膜细胞产生CCL5浓度较低，不利于观察MTX和TG的作用，为此我们加用5μg/ml的细菌脂多糖（LPS）刺激滑膜细胞CCL5的产生，同时加入或不加入不同浓度的MTX或TG，培养48h，收集上清，置-30℃保存备用。    1.4  CCL5测定  采用酶联免疫吸附（ELISA）方法，CCL5定量测定试剂盒（美国R&D公司生产）测定敏感度为3.1pg/ml，操作按试剂盒说明书进行。    1.5  统计学处理  两者间计数资料用t检验，CCL5水平与药物浓度的相关性分析采用直线相关回归分析。    2  结果    ２.1  RA和OA滑膜细胞体外产生CCL5的检测结果  见图1。由图1可见，RA滑膜细胞体外产生CCL5较OA滑膜细胞明显增高（P<0.05）。用LPS刺激后，RA和OA滑膜细胞产生CCL5均较未刺激的滑膜细胞显著增高（P<0.001）。图1　RA和OA滑膜细胞体外产生CCL5的检测结果     2.2  MTX和TG对RA滑膜细胞产生CCL5的影响  见图2。由图2可见，MTX和TG均可显著性抑制LPS诱导的RA滑膜细胞产生CCL5。MTX的抑制效果随剂量增大而增强，当浓度为20ng/ml时达最大效果，之后其剂量的增加并不能进一步抑制CCL5的产生。而TG并未显示出剂量依赖性抑制效应，仅当浓度达到或超过60ng/ml出现比MTX更显著的抑制作用。用台盼蓝染色法，对刺激后存活细胞计数发现，不同浓度的MTX刺激后存活细胞数与单用LPS刺激并无差异。但用TG 60ng/ml刺激后，当剂量达到100ng/ml，几乎所