作者：盛迅伦，吴伟民，庄文娟，容维宁，王娟，夏美华，章玲【摘要】  目的  检测视网膜母细胞瘤(RB)病人体细胞中RB1基因突变，探讨RB1基因突变的分子生物学机制。方法  应用PCR-SSCP技术筛查RB病人白细胞基因组DNA，测序分析确定突变。结果  在12例RB病人中，确定3例RB1基因生殖细胞性突变。他们分别是第10外显子中T至A杂合性突变， 将苯丙氨酸编码序列变为酪氨酸编码序列；第10外显子1bp碱基缺失 (GAT→AT)， 发生阅读框架改变；第22外显子中 A至T杂合性突变， 将精氨酸序列变为终止密码。结论  这3例RB1基因生殖细胞性突变的方式为点突变和小缺失，这些突变改变了RB1基因的遗传信息，致使异常的RB1基因蛋白产生，导致视网膜母细胞瘤的发生。    【关键词】  视网膜母细胞瘤  基因  突变  RB1    Detection of heterozygous mutations of RB1 gene in patients with retinoblastoma     【Abstract】  Objective  To study RB1 heterozygous mutations in patients with retinoblastoma.Methods  Genomic DNA was used as a template for the PCR reaction to amplify all exons of RB1 gene.These PCR products were screened by single strand conformation polymorphism (SSCP) and subjected to direct sequencing.Results  Three germcell mutations in the RB1 gene were identified in collected genomic DNA from RB patients:a T to A transition (TTC→TAC) at exon 10，a deletion G (GAT→AT) at exon 10，a  A to T transition (AAG→ATG) at exon 22.Conclusion  Mutations in RB1 gene are involving a few base pairs in this study.As a result of such mutation，the normal function of RB is usually disrupted，and retinoblastoma occurred.    【Key words】  retinoblastoma  gene  mutation  RB1        视网膜母细胞瘤（简称RB），是婴幼儿最多见的高度恶性、致死率高的眼内恶性肿瘤。由视网膜母细胞瘤基因(RB1基因)的两条等位基因同时失活所致，分遗传型（30%～40%）和非遗传型（60%～70%）两种方式。遗传型视网膜母细胞瘤病人体细胞都携带RB1基因生殖细胞性突变，85%～90%可能会发生双眼或单眼多灶型视网膜母细胞瘤，下一代子女中约有50%的机会遗传这一突变的基因，而其中的90%会患视网膜母细胞瘤［1，2］。因而，基于RB1基因生殖细胞性突变检测(遗传分型、产前与症状前基因诊断)，目前是视网膜母细胞瘤的预防与早期诊断的有效途径。为了进一步了解RB病人RB1基因的突变特点，为临床遗传检查提供更多可靠的信息，笔者应用分子生物学技术对RB病人体细胞中RB1基因进行突变位点的检测，并结合以前的工作［3］，探讨了RB1基因突变的分子生物学机制。    1  资料与方法    1.1  一般资料  共收集散发RB病人12例，4例为双眼RB，其他8例为单眼RB，年龄1～5岁；同时收集了12例无亲属关系的健康人作为正常对照组。    1.2  方法    1.2.1  DNA提取  采外周静脉血10ml，应用DNA分离试剂盒（Promega公司产品）提取全血白细胞DNA。    1.2.2  聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）  应用美国PE 公司2400型PCR仪。参照Toguchida［4］报道的方法进行PCR引物设计。PCR反应体系：10×Buffer 2μl（含MgCl2 10 mmol/L），2×dNTP 2μl （2mmol/L）引物2μl（10mmol/L），DNA模板1μl （1mmol/L），Taq plus I DNA聚合酶0.5μl（510u/L），加双蒸水至100μl。95℃变性1min进入循环。95℃ 30s，退火30s，退火温度50℃～70℃（不同外显子，不同温度）。72℃延伸30s，共30个循环。最后72℃ 再延伸7min。PCR扩增产物的分析：取扩增产物5μl在1.5%琼脂糖凝胶电泳后进行EB染色，同时加Marker标记DNA相对分子质量。透射紫外线观察DNA电泳带，照相。    1.2.3  单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP） 分析  将PCR产物置95℃下变性10min，加入10%非丙烯酰胺电泳槽孔中，50℃，2h，电压200～400V，银染、显带、干燥。    1.2.4  DNA测序  通过SSCP分析如发现有变异带出现，则将该PCR产物利用双脱氧末端终止法进行直接测序。    2  结果     通过PCR-SSCP分析，在12例病人中发现3例SSCP电泳有变异DNA单链带（图1～3）。其中2例经临床及病理检查确诊为双眼RB，1例为单眼RB。这3例病人均无家族史。PCR产物克隆测序分析显示:例1(3号)双眼RB病人10号外显子5’端至3’端第22bp处发生 T→A置换，由TTC变为TAC，将苯丙氨酸编码序列变为酪氨酸编码序列(图1)；例2(7号)双眼RB病人10号外显子5’端至3’端第64bp处发生1bp碱基缺失(GAT→AT) (图2)，发生阅读框架改变；例3(14号)22号外显子5’端至3’端第36bp处发生 A→T置换，由AGA变为TGA，将精氨酸序列变为终止密码(图3)。                                                      图1                   图2                    图3 图1   A：SSCP电泳图：例1双眼RB患儿，10号外显子电泳带显示超前的异常泳动带形（第1号标本）；          B：RBI基因突变测序图：10号外显子第64352碱基处发生T→A置换（TTC→TAC） 图2   A：SSCP电泳图：例2以眼RB患儿，10号外显子电泳带显示超大型前的异常泳动泳动带形（第1号标本）；        B：RBI基因突变测序图：10号外显子第64352碱基处发生Ibp碱基缺失（GAT→AT） 图3   A：SSCP电泳图：例3单眼TB患儿，22号外显子电泳 带显示滞后的异常泳动带形（第1号标本）；        B：RBI基因突变测序图：22号外显子第162137碱基处发生A→T置换（AGA→TGA）      3  讨论          RB1基因（视网膜母细胞瘤易患基因）位于人类13号染色体长臂1区4带，有27个外显子，分布范围180kb，转录一4.7kbmRNA，其蛋白产物为一115kb核内磷酸蛋白。各种原因致使RB1基因失活是视网膜母细胞瘤发生的直接原因。    RB分遗传性和非遗传性两种。遗传性和非遗传性病例发病特征的差别可以用Knudson的二次突变学说解释。Knudson于1971年提出的二次突变学说认为RB发生要经历两次突变。遗传性第一次突变是生殖细胞突变，由此发育而来的子代所有体细胞均带有一次突变，表现肿瘤易感性。视网膜任何一个细胞只需发生一次突变即可发生RB，而其他部位体细胞也只需一次突变即可发生恶性肿瘤，故RB发生早，多中心，发生第二肿瘤危险性高，且可遗传。这种生殖细胞突变可以来自病人父母的遗传（有家族史），但以胚胎发育早期的生殖细胞新发生的突变更多见（无家族史），非遗传型RB病人中，生殖细胞遗传了正常的两个RB基因，两次突变需发